各種動物臟器組織單核細(xì)胞分離液實(shí)驗(yàn)方法說明書
各種動物臟器組織單核細(xì)胞分離液實(shí)驗(yàn)方法說明書
【產(chǎn)品規(guī)格】
2×200ml/Kit
【產(chǎn)品組成】方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：
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| 名稱 | 產(chǎn)品編號 |
| 規(guī)格 |
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| A | 試劑Ａ |
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| 200ml |
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| B | 試劑Ｄ |
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| 200ml |
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| C | 樣本稀釋液（贈品） | 2010C1119 |
| 200ml |
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| D | 清洗液（贈品） |
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| 2010X1118 |
| 200ml |
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| E | F 液（贈品） |
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| F2013TBD |
| 200ml |
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| Ｆ | 說明書 |
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| 1 份 |
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【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】 |
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A． 適用儀器 |
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| zui大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī) |
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B． 耗材 |
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| 產(chǎn)品名稱 |
| 產(chǎn)品貨號 |
| 產(chǎn)地 |
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| 15ml 離心管散裝 |
| 339650 |
| 美國 NUNC |
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| 15ml 離心管架裝 |
| 339651 |
| 美國 NUNC |
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| 50ml 離心管散裝 |
| 339652 |
| 美國 NUNC |
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| 50ml 離心管架裝 |
| 339653 |
| 美國 NUNC |
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| 無菌膠頭滴管或塑料滴管 |
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【檢驗(yàn)方法】 |
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全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。
1首先制備臟器組織單細(xì)胞懸液，制備方法詳見“組織單細(xì)胞懸液制備技術(shù)”。
2取一支 15ml 的離心管，依次小心加入試劑 A、試劑 D（體積比為 3:2，試劑總量與樣本量相等。如臟器組織單細(xì)胞懸液為 5ml，則先后加入試劑 A 3ml、試劑 D 2ml），制成梯度界面，各液面分層一定要清晰。
3用吸管小心吸取臟器單細(xì)胞懸液樣本加于分離液液面上，400-550g，離心 20-30min（注：根據(jù)臟器單細(xì)胞懸液量確定離心條件，樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到*分離效果）。
4離心后，此時離心管中由上至下分為五層。*層為稀釋液層。第二層為透明試劑 D 液層。第三層為環(huán)狀乳白色單核細(xì)胞層。第四層為透明試劑 A 液層。第五層為紅細(xì)胞層。
5 用吸管小心吸取第二層試劑 D 層和第三層乳白色細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，往所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細(xì)胞。
6 250g，離心 10min。
7棄上清。
8用吸管以 5-10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
9 250g，離心 10min。
10重復(fù) 7、8、9，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
11 差異貼壁法純化細(xì)胞
（1）用單核細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號：CTBD2011）或單核細(xì)胞*培養(yǎng)基（產(chǎn)品
編號：HCTBD2011）以 1.5-3×106 個/ml 的密度重懸細(xì)胞，將細(xì)胞鋪于一次性細(xì)胞板或細(xì)胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。
（2）2-4 小時內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體（俗稱為單核細(xì)胞）。
（3）10-24 小時內(nèi)貼壁的單個核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞。（4）不貼壁的為淋巴細(xì)胞。
注：
a）無血清培養(yǎng)基中不含任何動物成分，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或2-8%經(jīng)灝洋篩選的胎牛血清。
b)*培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定）。
c)由于每種細(xì)胞的貼壁時間存在差異可將所得細(xì)胞分開已達(dá)簡單的純化目的，此法成本相對較低。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰
性分選。
【注意事項(xiàng)】
1 全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得*的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在取樣 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣本存放時間越長，細(xì)胞分離效果越差。樣本放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。
2 本實(shí)驗(yàn)不使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無靜電、低靜電離心
心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會
變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。
3 吸取過多的單核細(xì)胞層及分離液層會導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加。
4 分離液用量大于臟器組織單細(xì)胞懸液樣本量時，分離效果更佳。
5 如實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過低，請?zhí)旖驗(yàn)笠詫で髱椭唧w詳見下方生產(chǎn)企業(yè)信息。
【儲存條件及有效期】
18-25℃保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】
本實(shí)驗(yàn)單核細(xì)胞提取率大于 80%。
下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。
| 紅細(xì)胞 |
| 白細(xì)胞 |
| 血小板 |
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| （4.0-10.0）×109 |
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含量（個/L） | （4.0-5.5）×1012 | 中性粒細(xì)胞 | 淋巴細(xì)胞 | 單核細(xì)胞 | （1.0-3.0）×1011 |
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| 50%-70% | 20%-40% | 3%-8% |
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【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】
1 臟器組織單細(xì)胞懸液制備技術(shù)。
2 所獲得單核細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。
3 所獲得單核細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。
4 所獲得單核細(xì)胞的鑒定方法
A.流式細(xì)胞技術(shù)
B.免疫組化技術(shù)
C.原位雜交技術(shù)
D.PCR 技術(shù)
【可能存在的問題及解決方法】
1.由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：
| 出現(xiàn)情況 | 出現(xiàn)原因 | 建議解決方案 |
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| 離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層 | 轉(zhuǎn)速過小或離心時間過短 | 適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速 |
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| 離心后目的細(xì)胞存在于分離液中 | 轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長 |
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| 離心后白環(huán)層彌散 | 細(xì)胞密度過大 | 調(diào)整細(xì)胞密度 |
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| 離心后白環(huán)層太淺或看不見 | 細(xì)胞密度過小 |
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2 本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對離心條件進(jìn)行調(diào)整時，恒定離心時間，對離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。
3 本分離液依照標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級原料，性能指標(biāo)與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。
注：在對離心條件進(jìn)行調(diào)整時，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到*分離效果，
離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min 為準(zhǔn)。
