人外周血淋巴細胞分離液步驟
更新時間：2016-11-14 點擊：2093
人外周血淋巴細胞分離液步驟,將采到的肝素抗凝血取樣計數白細胞總數.使用Hank’s液/PBS液/無血清RPMI1640將血樣1：1稀釋，混勻時要沿管壁吹出，避免產生氣泡。吹勻后于37℃水浴中平衡.從冰箱中取出4℃避光保存的淋巴細胞分離液。搖勻后在無菌狀態下加入刻度離心管中。操作中盡量避免吸管碰觸管壁。原則上分離液的高度不超過管高的1/4.將盛有分離液的離心管放入37℃水浴中平衡.用吸管將稀釋的血液沿離心管壁徐徐加到分離液面上，用力要輕，避免血液沖入分離液中，使得稀釋血重疊在分離液面以上，擰緊管蓋。稀釋血與分離液的高度比在1：2-2：1之間。原則上兩者的總高度不超過離心管的2/3。
人外周血淋巴細胞分離液將離心管放置于水平離心機中，室溫下 2000rpm離心20min。離心過程中要觀察離心速度是否正確，且在停止時選擇“no break”，避免因為急劇減速將已經分離的單個核細胞層重新弄混。注意離心結束時的減速過程，不要太快.離心結束后可見管內分為四層，從上至下分別為：血漿層（含部分血小板）、白膜層（含單個核細胞及少量血小板）、分離液層、粒細胞及紅細胞層。將吸管輕輕穿過血漿層至白膜層，沿離心管周緣吸出血漿層與分離液層界面間的白膜層細胞，置于新離心管中。盡量少吸取分離液。
人外周血淋巴細胞分離液zui后一次離心完畢傾倒出上清液后請要度離心管，將管底細胞搖勻。根據上一步的計數結果，用含FBS10%-20%、雙抗的RPMI1640培養液將細胞配成所需濃度.核心技術,如實陳述.
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