無內毒素快速質粒大量提取試劑盒 操作流程
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備注：本公司銷售的所有產品僅用于生化科研試驗
英文名稱：EndoFree plasmid ezFlow maxi kit
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試劑盒組分
1. 取100 µL新鮮的菌液接種到150-200 mL （勿超過 200 mL）的LB培養基（含適量抗生素），37oC震蕩培養14-16小時。室溫下5,000 x g離心10分鐘，收集菌體，并盡可能的吸去上清。注：殘留的液體培養基容易導致菌液裂解不充分，離心后沉淀較松，不能有效吸取上清。注：本說明書中的操作程序適用于標準LB （Luria Bertani）培養基培養12-16 小時后，OD600（細菌密度）在2.0-3.0之間的菌液。若采用的是富集培養基，例如TB 或2×YT，請注意保證OD600不超過3.0。 2. 加入10 mL Buffer A1（確保已加入RNase A），用移液器或渦流震蕩確保細菌沉淀重新懸浮。 注：不*懸浮易導致菌體裂解不*，從而使產量降低。 3. 加入 10 mL Buffer B1, 輕輕地反轉5-10 次以混合均勻，然后靜置2-5分鐘至溶液粘稠而澄清。 注：切勿劇烈振蕩。靜置時間不應超過5分鐘，時間過長會導致基因組DNA污染或質粒受到破壞。若溶液未清亮澄清，則表明菌體裂解不充分，應加大Buffer B1的用量或減少菌體量。 4. 加入3 mL Buffer N3, 立即反轉5次，用手用力搖晃3-5次充分混勻，此時出現白色絮狀沉淀。 5. 將離心管轉至高速離心機，在室溫下12,000 x g離心10分鐘（若上清中有白色沉淀，可再次離心）。注：低溫下RNase不工作，易有RNA污染。如果離心機轉子較冷，將離心管在室溫下溫育10分鐘后再離心。若無告速離心機，可用Syringe filter替代（在PD1522中提供，也可單獨購買）。 6. 轉移上清液20 mL（不超過20 mL）至新的50mL離心管中，加入0.5倍體積的Buffer RET （即每20 mL裂解液加入10 mL Buffer RET） 及10 mL的100% ethonal，用手用力甩5次以混勻，需馬上離心過DNA柱。 7. 立即轉移20 mL裂解液/收集管至帶收集管的DNA柱中，室溫下> 2,500 x g離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。將剩余溶液轉移至DNA柱中，室溫下> 2,500 x g離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。重復直至所有的溶液通過DNA柱。注：如果50 mL的收集管與離心機轉子不符，可在臺式離心機> 2,500 x g 離心2分鐘。 8. 向離心柱中加入10 mL 70% 乙醇，室溫下> 2,500 x g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。重復步驟“9”。 9.將離心柱放回高速離心機中，室溫下5,000 x g開蓋離心10分鐘，以*去除殘留的乙醇。注：此步驟中開蓋離心將會更有效的去除殘留的乙醇，乙醇是否去除干凈將會影響zui后的洗脫效率。若轉速低于5,000 x g，需離心20分鐘，并可放在空氣中晾干。 10.將離心柱轉至一個新的50 mL離心管中，向DNA柱膜的正中加入1-1.5 mL 的Endofree Elution Buffer，室溫放置1分鐘，> 2,500 x g離心5分鐘，以洗脫質粒DNA。將50 mL離心管中的洗脫液上柱再放置洗脫1分鐘，> 2,500 x g離心5分鐘。 兩次洗脫將提高得率。注：提取到的質粒DNA可用于轉染內毒素敏感性細胞株，原代細胞及用于微注射，建議去除內毒素。 操作流程： | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
