胰蛋白酶分散技術
胰蛋白酶(簡稱胰酶)是廣泛應用的消化劑。胰蛋白酶是一種胰臟制品,對蛋白質有水介作用,主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵,使細胞間質中的蛋白質水介而使細胞分散開,在常用的蛋白酶中由于產品的活力和純度不同,對細胞的消化能力也不同,胰蛋白酶對細胞的作用,取決于細胞類型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無機鹽離子、pH以及消化時間的長短等。
①細胞類型 胰蛋白酶適于消化細胞間質較少的軟組織,能有效地分離肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等。而對含結締組織較豐富的組織,如 乳腺、滑膜、子宮、纖維肉瘤、腫瘤組織等就無效,但若與膠原酶合用,就能增加其對組織的分離作用。
②酶的活力 市售的胰蛋白酶,其活力都經過測定而有效,但配制時必須新鮮,需保存在低溫冰箱中,消化時的pH和溫度都要適宜,否則會影響活力,細胞的分散直接與酶的活力有關,zui終使用活力為1:200或1:250,56℃pH8.0時活力zui強。
該酶為粉劑,保藏時要防潮,室內溫度不宜過高,保存時間不能太長,若粉劑結團塊,說明該部分受潮或失效。
③酶的濃度 胰蛋白酶一般采用的濃度為0.1%~0.25%(活力1:200或1:250),但遇到難消化的組織時,濃度可適當提高,消化時間適當延長。濃度高對細胞有毒性,而較低濃度的胰蛋白酶在培養液中可促進細胞的增殖,若培養液中加入血清,其少量胰蛋白酶可被血清中抗胰蛋白酶因子所清除。
④溫度 一般認為胰蛋白酶在56℃時活性zui強,但由于對細胞有損害而不能被采用,常使用的溫度為37℃,通常在37℃進行消化比室溫作用快。
⑤pH pH8~pH9是胰蛋白酶活力適宜范圍,但隨堿性的增加其活力也隨之減少,活性強分散快,細胞也容易被消化下來,消化分離細胞時PH只能選用7.6~8.0之間,否則對細胞有損傷。
⑥無機鹽離子 若用含有鈣和鎂的鹽類溶液來配制胰蛋白酶時,可以發生抑制胰蛋白的消化作用。因此,在配制時應采用無鈣鎂離子的PBS配制。
⑦消化時間 如果細胞消化時間過長,可以損害細胞的呼吸酶,從而影響細胞的代謝,一般消化時間為20min為宜,冷消化時使用低濃度消化液,于4℃過夜也可。
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