動(dòng)物脾臟組織中性粒細(xì)胞分離液 KIT 說(shuō)明書(shū)
動(dòng)物脾臟組織中性粒細(xì)胞分離液 KIT 說(shuō)明書(shū)
【產(chǎn)品規(guī)格】
200ml/Kit
【產(chǎn)品組成】
為方便廣大用戶(hù)使用，試劑內(nèi)容如下：
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| 名稱(chēng) | 產(chǎn)品編號(hào) |
| 規(guī)格 |
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| A | 試劑 A |
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| 200ml |
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| B | 試劑 F（贈(zèng)品） |
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| F2013TBD |
| 200ml |
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| C | 樣本稀釋液（贈(zèng)品） | 2010C1119 |
| 200ml |
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| D | 清洗液（贈(zèng)品） |
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| 2010X1118 |
| 200ml |
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| E | 紅細(xì)胞裂解液（贈(zèng)品） | NH4CL2009 |
| 100ml |
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| F | 說(shuō)明書(shū) |
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| 1 份 |
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【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】 |
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A． 適用儀器 |
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| zui大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī) |
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B． 耗材 |
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| 產(chǎn)品名稱(chēng) |
| 產(chǎn)品貨號(hào) |
| 產(chǎn)地 |
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| 15ml 離心管散裝 |
| 339650 |
| 美國(guó) NUNC |
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| 15ml 離心管架裝 |
| 339651 |
| 美國(guó) NUNC |
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| 50ml 離心管散裝 |
| 339652 |
| 美國(guó) NUNC |
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| 50ml 離心管架裝 |
| 339653 |
| 美國(guó) NUNC |
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無(wú)菌膠頭滴管或塑料滴管
【檢驗(yàn)方法】
1.全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。
2.首先制備脾臟組織單細(xì)胞懸液，制備方法詳見(jiàn)“組織單細(xì)胞懸液制備技術(shù)”。
取一支 15ml 離心管，小心加入 5ml 試劑 A。
3.用吸管小心吸取細(xì)胞懸液樣本加于分離液之液面上，400-550g ，離心 20-30min（注：如改變樣本及分離液用量，需相應(yīng)調(diào)整離心力及離心時(shí)間，具體離心條件需客戶(hù)自行摸索，以達(dá)到*分離效果）。
4.離心后，離心管中將出現(xiàn)兩層環(huán)狀乳白色細(xì)胞層，上層細(xì)胞為單個(gè)核細(xì)胞層，下層細(xì)胞為中性粒細(xì)胞層。
5.用吸管小心吸取分離液中的中性粒細(xì)胞層，如有紅細(xì)胞混雜則加入適量紅細(xì)胞裂解液（產(chǎn)品編號(hào)：NH4CL2009）將紅細(xì)胞裂解（具體方法見(jiàn)“紅細(xì)胞裂解液使用說(shuō)明”）即得目的細(xì)胞。
6.將獲得的細(xì)胞層移至另一 15ml 離心管中，向所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。
7.250g，離心 10min。
8.棄上清。
9.用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。
10.250g，離心 10min。
11.重復(fù) 8、9、10，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
【注意事項(xiàng)】
1.全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得*的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需在取樣 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
2.本實(shí)驗(yàn)不使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無(wú)靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過(guò)后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會(huì)變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。
3.分離液用量大于脾臟組織單細(xì)胞懸液樣本量時(shí)，分離效果更佳。
4.如實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過(guò)低，請(qǐng)?zhí)旖驗(yàn)笠詫で髱椭唧w詳見(jiàn)下方生產(chǎn)企業(yè)信息。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
18-25℃保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無(wú)菌條件操作。無(wú)菌條件下操作，啟
封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
【參考值（參考范圍）】
本實(shí)驗(yàn)中性粒細(xì)胞提取率大于 80%。
下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶(hù)可適當(dāng)進(jìn)行參考。
| 紅細(xì)胞 |
| 白細(xì)胞 | 血小板 | |
含量（個(gè)/L） | （4.0-5.5）×1012 | （4.0-10.0）×109 | （1.0-3.0）×1011 | ||
中性粒細(xì)胞 | 淋巴細(xì)胞 | 單核細(xì)胞 | |||
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50%-70% 20%-40% 3%-8%
【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】
1.脾臟組織單細(xì)胞懸液制備技術(shù)。
2.所獲得中性粒細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。
3.所獲得中性粒細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。
4.所獲得中性粒細(xì)胞的鑒定方法A.流式細(xì)胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù)C.原位雜交技術(shù)D.PCR 技術(shù)
【可能存在的問(wèn)題及解決方法】
1.由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問(wèn)題及解決方案如下表所示：
出現(xiàn)情況 | 出現(xiàn)原因 | 建議解決方案 |
離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層 | 轉(zhuǎn)速過(guò)小或離心時(shí)間過(guò)短 | 適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速 |
離心后目的細(xì)胞存在于分離液中 | 轉(zhuǎn)速過(guò)大或離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng) | |
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離心后白環(huán)層彌散 | 細(xì)胞密度過(guò)大 | 調(diào)整細(xì)胞密度 |
離心后白環(huán)層太淺或看不見(jiàn) | 細(xì)胞密度過(guò)小 | |
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2.本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶(hù)可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，恒定離心時(shí)間，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。
3.本分離液依照標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級(jí)原料，性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類(lèi)產(chǎn)品略有不同，可能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。
注：在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到*分離效果，
離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。
