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--組織單細胞懸液的制備方法

更新時間:2016-06-07      3978

 

組織單細胞懸液的制備

(全過程及所需試劑要求無菌環境)

 

 

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備注:本公司銷售的所有產品僅用于生化科研試驗

 

 

剪碎法:

將組織塊放入平皿后,加入少量PBS+10%胎牛血清;用眼科剪將組織剪至勻漿狀,加入10 ml PBS+10%胎牛血清;用吸管吸取組織勻漿,用100 目不銹鋼濾網過濾到試管內;離心沉淀1500 rpm×3 min,再用PBS+10%胎牛血清洗3 次,每次以500 rpm 短時低速離心除去細胞碎片,以200 目不銹鋼濾網過濾去細胞團塊。作細胞計數并調整細胞濃度為(25×107 /ml。常溫下放置, 待測細胞的活力。分離前用胎牛血清懸起細胞濃度為1×107/ml 的單細胞懸液備用。

 

勻漿器法:

用眼科剪將組織剪成小塊;放入70 ml 組織研磨器內,加入2 ml PBS+10%胎牛血清;緩慢轉動研棒,研磨至勻漿;用10 ml PBS+10%胎牛血清沖洗研器;收集細胞懸液,經200 目不銹鋼濾網過濾;離心沉淀800 prm×2 min ,再用PBS 3 次,離心沉淀。以下處理同剪碎法。

 

細胞計數方法:

細胞計數法是用來計數細胞懸液中細胞數量的一種方法。一般利用計數板(血球計數板)進行。即可用于分離(散)細胞培養接種前計數所制備的細胞懸液中的細胞數量,也可用于對培養物的細胞數量進行計數。不論計數的對象如何,均須制備分散的細胞懸液。

計數與計算過程:

1)、在細胞計數板中央放置計數的蓋玻片。

2)、用玻璃虹吸管吸取細胞,讓虹吸管在蓋玻片上或下側的計數板凹蹧處流出懸液,至蓋玻片被液體充滿為止。

3)、置顯微鏡下計數四角大方格內的細胞總數。對于壓線的細胞只計數在上線和左線者,對于細胞團按單個細胞計數。

4)、按下式計數細胞懸液的密度:細胞密度=(4 個大格細胞總數/4×104 /ml ×稀釋倍數公式中乘以104 因為計數板中每一個大格的體積為:1.0mm(長)×1.0mm(寬)×0.1mm(高)=0.1mm3 1ml1000mm3

細胞計數要點:

1.進行細胞計數時,要求懸液中細胞數目不低于104 /ml,如果細胞數目很少要進行離心再懸浮于少量培養液中;顯微鏡下計數時,遇到2 個以上細胞組成的細胞團,應按單個細胞計算。如果細胞團>10%,說明細胞分散不充分; 或細胞數<200 /10mm2 >500 /10 mm2時,說明稀釋不當,需重新制備細胞懸液。

2.要求細胞懸液中的細胞分散良好,否則影響計數準確性。

3.取樣計數前,應充分混勻細胞懸液,尤其是多次取樣計數時更要注意每次取樣都要混勻,以求計數準確;

4. 數細胞的原則是只數完整的細胞,若細胞聚集成團時,只按照一個細胞計算。如果細胞壓在格線上時,則只計上線,不計下線,只計左線,不計右線。

5. 操作時,注意蓋玻片下不能有氣泡,也不能讓懸液流入旁邊槽中,否則要重新計數。

初學者易犯的錯誤:

1. 計數前未將待測懸液吹打均勻。

2. 滴入細胞懸液時蓋玻片下出現氣泡。

3. 滴入懸液時的量太多,至使細胞懸液流入旁邊的槽中。

 

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